Thiết kế mồi cho phản ứng PCR (Phần 2)

  • Chi tiết bài viết
  • Bài viết liên quan

Bài Thiết kế mồi cho phản ứng PCR (Phần 1) đã nói về nguyên lý để giúp thiết kế cặp mồi cho một phản ứng PCR. Tuy vậy, việc thiết kế mối khó có thể được thực hiện thủ công vì có quá nhiều thông số phải tính đến. Do đó các nhà tin sinh học đã phát triển rất nhiều phần mềm trợ giúp công việc thiết kế mồi. Trong bài này sẽ hướng dẫn chi tiết cách sử dụng một phần mềm thiết kế mồi phổ biến và miễn phí là Primer-Blast để thiết kế cặp mồi mong muốn. Hơn nữa, bài viết còn giới thiệu và đưa ra sự so sánh giữa một số phần mềm thiết kế mồi khác nhau.

      1. Hướng dẫn sử dụng phần mềm thiết kế mồi Primer – Blast

Primer-BLAST là một công cụ được phát triển bởi NCBI giúp người dùng thiết kế mồi đặc hiệu cho một phản ứng PCR cụ thể. Primer-BLAST sử dụng mã nguồn mở Primer3 để thiết kế mồi, sau đó dùng công cụ  BLAST và thuật toán định tuyến tổng quát (global alignment) để kiểm tra trong cơ sở dữ liệu của NCBI nhằm tránh các sai sót kết cặp, tương đồng chéo là nguyên nhân dẫn đến phản ứng PCR không hiệu quả.

Quá trình thiết kế đoạn mồi sử dụng Primer-BLAST thường diễn ra theo 2 bước:

  • Thu thập khuôn mẫu
  • Thiết kế đoạn mồi

      1.1. Thu thập khuôn mẫu

Một ưu điểm khá lớn khi sử dụng Primer-BLAST là người dùng có thể tận dụng tối đa nguồn cơ sở dữ liệu từ NCBI.

Ví dụ sau đây chúng tôi sẽ hướng dẫn thiết kế mồi cho đoạn gen YP_009173871.1 quy định cấu trúc vỏ nhỏ protein của virus viêm gan siêu vi B.

Bước 1: Truy cập cơ sở dữ liệu của NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) chọn “Nucleotide database” và tìm kiếm sử dụng từ khóa “Hepatitis B virus genome”.

Bước 2: Kết quả trả về là hàng loạt các dữ liệu bộ gen khác nhau của virus viêm gan siêu vi B. Chúng ta sẽ chọn kết quả đầu tiên. Ở phần kết quả số 1 này, sẽ có 3 định dạng là: GenBank, FASTA và Graphics. Để thu chuỗi khuôn mẫu chúng ta có thể chọn FASTA hoặc Graphics nhưng chúng tôi có lời khuyên nên sử dụng Graphics của NCBI thì sẽ hiệu quả hơn rất nhiều. Vì vậy ở mục này chúng ta sẽ chọn Graphics để đánh giá trực quan toàn bộ bộ gen của virus (xem hình 1).

1

Bước 3: Bộ gen của virus được biểu diễn dưới dạng hình ảnh trực quan (Hình 2). Toàn bộ các gen đều được chú thích và khi click vào từng gen sẽ hiện ra thông tin chi tiết về gen đó.

Trong ví dụ này, chúng ta sẽ chọn gen YP_009173871.1 quy định cấu trúc vỏ nhỏ protein.

1

Bước 4: Bảng nhỏ hiện lên sau khi chúng ta chọn gen có chứa dòng “FASTA View” . Click vào vào mục 1 bắt đầu bằng ký hiệu NC_ sẽ hiện ra chuỗi của gene này dưới dạng file FASTA (hình). Vậy bước đầu thu thập khuôn mẫu đã hoàn thành trên cơ sở dữ liệu NCBI

Lưu ý: Như ở phần Graphics trên còn cung cấp cho chúng ta những đoạn gen theo chiều ngược lại (Gen mang màu đen). Vì vậy trước khi thực hiện thiết kế mồi, chúng ta cần phải đảo ngược đoạn khuôn mẫu này lại cho đúng chiều 5’-3’.

1        1.2. Thiết kế đoạn mồi

Bước 1: Truy cập trang chủ của phần mềm Primer-BLAST tại địa chỉ: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/. Giao diện chính của Primer-BLAST như hình.

(1)  Khung nhập dữ liệu chuỗi khuôn mẫu: Nhập chuỗi dưới dạng file FASTA

(2)  Thông số về nhiệt độ nóng chảy (Tm )của đoạn mồi : điều chỉnh giống với thông số của nguyên tắc thiết kế mồi ở phần 1 của loạt bài viết về thiết kế mồi cho phản ứng PCR

Ngoài ra còn rất nhiều các thông số nâng cao khác nhưng ở bài này chúng ta sẽ chỉ đi về mặt cơ bản. Vì thế hầu hết các thông số sẽ ở dạng mặc định.

1

Bước 2: Đánh giấu bỏ dòng “Enable search for primer pairs specific to the intended PCR template” để bỏ qua việc tìm kiếm cặp mồi có sẵn trong cơ sở dữ liệu của NCBI. Sau đó chúng ta thu về thiết kế primer bằng cách ấn vào ô “Get Primers”.

1

Cuối cùng, kết quả đoạn mồi thu được sẽ ở 2 dạng: hình ảnh trực quan và thông tin chi tiết về kết quả.

1

1

       2. Đánh giá các phần mềm phổ biến hiện nay

  • Phần mềm FastPCR là công cụ tích hợp hàng loạt các tính năng toàn diện và chuyên nghiệp dùng để thiết kế mọi loại mồi cho PCR. Mặc dù vậy, điểm yếu của phần mềm này là sự quá phức tạp khi sử dụng.
  • Primer-BLAST là một phần mềm online được cung cấp bởi The National Center for Biotechnology Information (NCBI). Phần mềm này được tạo nên nhờ sự kết hợp giữa Primer3 và BLAST. Nổi trội nhờ khả năng sử dụng cơ sở dữ liệu lớn của NCBI bằng BLAST nhưng là một công cụ online, Primer-BLAST không tránh khỏi những hạn chế.
  • Primer3 là một phần mềm mã nguồn mở cực kỳ nổi tiếng và BatchPrimer3 là bản phát triển sau này. Đặc điểm nổi bật của BatchPrimer là việc chạy trên nền web online và khả năng chạy thông lượng lớn đầu vào giúp BatchPrimer3 là một trong những công cụ phổ biến trong thiết kế mồi cho PCR nhằm thay thế cho người anh Primer3.
Đặc điểm jPCR Tool &FastPCR NCBI/Primer-BLAST (Primer3) BatchPrimer3 (Primer3) IDT SciTools: PrimerQuest, OligoAnalyzer 3.1 PerlPrimer
Độ dài Primer (nt) 12-500 15-30 Chưa rõ 16-35 12-30
Giới hạn độ dài khuôn mẫu (nt) Không giới hạn 50,000 Chưa rõ Không giới hạn Không giới hạn
Tốc độ tính toán rất nhanh chậm chậm chậm chậm
Cho phép chạy thông lượng lớn với hàng loạt khuôn mẫu và hàng loạt mục tiêu trên khuôn cùng lúc không không không
Tùy chọn PCR cho khuôn mẫu
Degenerated nucleotides at all operation (Tm calculation, searches and probe, primer design etc.) không không
Cho phép sửa đổi LNA (Nucleotide đã khóa) hoặc các nucleotide khác không không không
Tính toán nhằm tối ưu hóa nhiệt độ anneal sử dụng không không không không
Kiểm tra đầu 3’ kết thúc của mồi giao và tự tạo dimer Lỗi
Kiểm tra mồi nội giao và tự tạo dimer Lỗi không Lỗi
Tìm kiếm khuôn mẫu sử dụng BLAST không không không
Kiếm tra khuôn mẫu không không không
Kiểm tra khuôn mẫu dựa trên thư viện sẵn có không không

Bảng 1: So sánh các công cụ thiết kế Primer và phân tích oligonucleotide phổ biến hiện nay

(http://primerdigital.com/tools/soft.html)

Ghi chú: Bảng so sánh trên mang tính chất tương đối vì do công ty cung cấp phần mềm jPCR Tool &FastPCR thống kê, vì thế khả năng các đặc điểm mang tính chất có lợi hơn so với các công cụ khác. Mặc dù vậy, đây là tài liệu đáng để tham khảo.

Tổng hợp: Phạm Trường Duy

Biên Tập: Vũ Đình Chất

Tham khảo:

  1. PrimerDigital.

Xin mời Quý Độc Giả bỏ ra 2-5 phút để làm một khảo sát mức độ hài lòng về bài viết của IBSG tại đây. IBSG chân thành cảm ơn Quý Độc Giả.

Ý Kiến Độc Giả:

Nhóm nghiên cứu: