ChIP-Seq: Kỹ thuật sinh học phân tử giúp xác định tương tác giữa protein và DNA trong tế bào

Một số thuật ngữ

• ChIP-seq viết tắt cho cụm từ “Chromatin immunoprecipitation sequencing”, tạm dịch là “Giải trình tự miễn dịch kết tủa chất nhiễm sắc”, là một kỹ thuật sinh học phân tử giúp xác định trình tự các vùng tương tác giữa các phân tử protein và DNA dựa vào phản ứng kết tủa đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể (KN-KT).
• Next generation sequencing (NGS): giải trình tự thế hệ mới
• Transcription factor (TF): yếu tố phiên mã, là các protein chịu trách nhiệm điều hòa hoạt động phiên mã.
• Formadehyde: được sử dụng để cố định mô và các tế bào vì khả năng tạo liên kết chéo giữa các amino acid của protein với các nguyên tử nitơ của các amino acid hay của DNA qua liên kết -CH2- (hình 1).

Hình 1: Phản ứng cố định liên kết giữa Protein và DNA.

Chú thích: Methylol: là các chất có nhóm hydroxymethyl -CH2-OH gắn với nguyên tử N. Schiff Base: còn gọi là Fuchsin, một hóa chất thông dụng dùng để định tính aldehyde.

• Hạt (bead): được sử dụng khi gắn vào kháng thể giúp thúc đẩy quá trình miễn dịch kết tủa. Có 2 loại hạt chính được sử dụng là hạt từ (magnetic bead) và hạt agarose (agarose bead).

Hình 2: Phản ứng gắn hạt vào kháng thể

• Proteinase K: còn gọi là protease K hay endopeptidase K, có khả năng phân hủy protein hay enzyme, được sử dụng trong quá trình tách chiết DNA.

Đặt vấn đề

Một nhà khoa học có mong muốn nghiên cứu về các vùng DNA tương tác với TF trong tế bào. Hiện tại, có rất nhiều kỹ thuật sinh học phân tử được đưa ra như: Điện di di dộng DNA (DNA Electrophoretic mobility shift assay), phân hủy DNA (Pull-down assay), chụp và phát hiện trên đĩa microplate (Microplate capture and detection),… Nhưng phương pháp được coi là tiên tiến nhất nhờ khả năng phát hiện các vùng tương tác một cách toàn diện bằng kỹ thuật giải trình tự thế hệ mới là ChIP-seq. ChIP-seq mang lại những ưu điểm về độ chính xác cao và thông lượng lớn trình tự các vùng tương tác giữa DNA và TF. Mặc dù vậy, để chuẩn bị thực hiện kỹ thuật này đòi hỏi các nhà nghiên cứu sở hữu một thư viện kháng thể đặc hiệu, thiết kế mồi phù hợp và đặc biệt là giá thành để chạy giải trình tự khá cao so với các phương pháp khác. Sau đây là 2 ứng dụng chính trong nghiên cứu của ChIP-seq:

• Nghiên cứu tương tác giữa các yếu tố phiên mã (TF) và sự biểu hiện của gene (gene expression) hay sự ảnh hưởng trực tiếp của chúng lên các quá trình sinh hóa, trạng thái bệnh của cơ thể.
• Chú giải hệ gene người bằng các vùng khởi đầu phiên mã hoặc mô típ giữa DNA và Protein.

Quy trình thực hiện

Nguyên lý: ChIP-seq lợi dụng mối liên kết chéo của phức hợp DNA – Protein thu về các đoạn DNA mục tiêu nhờ liên kết đặc hiệu gây kết tủa giữa kháng thể và Protein. Các DNA sẽ được giải trình tự thông lượng lớn một cách song song giúp rút ngắn thời gian và tăng hiệu quả so với các phương pháp cũ như PCR hay ChIP-Chip.

Bước 1: Cố định liên kết (màu đỏ) giữa Protein và DNA bằng cách đưa Formadehyde vào tế bào.

Bước 2: Phá hủy tế bào, sau đó sử dụng các phương pháp sinh học phân tử nhằm tách chiết nhiễm sắc thể đã được cố định với các protein.

Nhiệm vụ tiếp theo là cắt đứt DNA thành các đoạn ngắn để thu được phức hợp protein-DNA và DNA riêng rẽ. Hiện tại có 2 phương pháp chính: Cross-linked ChIP (XChIP) và Native ChIP (NChIP). Sự khác nhau giữa 2 phương pháp này chỉ nằm ở giai đoạn phá vỡ nhiễm sắc thể, chuẩn bị phức hợp Protein-DNA.

• XChIP phù hợp cho phát hiện tương tác giữa TF hoặc các protein nhiễm sắc thể liên quan khác với DNA. XChIP sử dụng sóng siêu âm với tần số cao làm phá vỡ mạch DNA thành các đoạn dài từ 300 – 1000 base pairs (bp).

NChIP thường được  dùng để tìm kiếm các vùng DNA mục tiêu của phân tử protein Histone. Như các bạn đã biết, DNA cuốn quanh Histone tạo thành nucleosome. Để tách phức hợp này, người ta thường sử dụng micrococcal nuclease (MNase) để tách các phức hợp Histone-DNA. Sau khi phân mảnh, mảnh DNA quấn quanh Nucleosome thường có độ dài 200bp hoặc quấn quanh 5 Nucleosome là 1000bp.

Bước 3: Kháng thể đặc hiệu của protein mong muốn phát hiện đã được gắn các bead được đưa vào dung dịch chứa các đoạn nhiễm sắc thể đã được phân mảnh thành các đoạn DNA ngắn. Sự kết tủa miễn dịch diễn ra bằng sự liên kết đặc hiệu giữa kháng thể đã gắn bead với các kháng nguyên của chúng là protein (có mang theo các đoạn DNA). Sau đó sử dụng li tâm và thu được tập hợp các phức hợp kết tủa DNA-protein-kháng thể-hạt.

Bước 4: Đun sôi -> làm lạnh, sự thay đổi nhiệt độ đột ngột làm phá vỡ các liên kết do formadehyde tạo ra. Đồng thời sử dụng enzyme Proteinase K giúp loại bỏ các protein cũng như giữ cho DNA không bị biến tính. Cuối cùng sẽ thu được một dung dịch chứa các đoạn nhỏ DNA phân mảnh mang thông tin các vùng liên kết với protein mong muốn.  

Bước 5: Giải trình tự các đoạn DNA phân mảnh bằng máy giải trình tự thế hệ mới. ChIP-seq mang hiệu quả vượt trội khi sử dụng NGS giúp giải trình tự song song với thông lượng lớn. Nếu chỉ dùng PCR thì chỉ có thể tìm được một loại protein cụ thể. Một phương pháp khác là ChIP-chip, có sử dụng công nghệ microarray nhưng cho thấy sai số (bias) cao hơn so với ChIP-seq khá nhiều.

Bước 6: Các đoạn trình tự DNA được giải mã sẽ được định vị (mapping) lên genome của loài nghiên cứu. Dựa vào độ bao phủ (coverage) sau khi giải trình tự. Vùng gene có khả năng gắn các protein hay TF sẽ được xác định nhờ vào các thuật toán, các công cụ tin sinh học.

Phạm Trường Duy

Biên tập: T.S. Triệu Anh Trung

Nguồn hình: Wikipedia, Strandngs

Tài liệu tham khảo:

1. Nelson, Joel D., Oleg Denisenko, and Karol Bomsztyk. “Protocol for the fast chromatin immunoprecipitation (ChIP) method.” NATURE PROTOCOLS-ELECTRONIC EDITION- 1.1 (2006): 179.
2. Schmidt, Dominic, et al. “ChIP-seq: using high-throughput sequencing to discover protein–DNA interactions.” Methods 48.3 (2009): 240-248.
3. Park, Peter J. “ChIP–seq: advantages and challenges of a maturing technology.” Nature Reviews Genetics 10.10 (2009): 669-680.