Giới thiệu phản ứng chuỗi polymerase pha rắn SP-PCR

  • Chi tiết bài viết
  • Bài viết liên quan

I. Giới thiệu:

Từ khi được phát minh vào năm 1983, phản ứng chuỗi polymerase (PCR) đã tạo ra một bước đột phá lớn cho ngành sinh học phân tử bằng cách cho phép các nhà nghiên cứu tạo ra số lượng bản sao không giới hạn của một đoạn DNA chỉ trong vài giờ. PCR thường được thực hiện bằng cách phối trộn các thành phần cần thiết vào tube. Sự khuếch đại sau đó diễn ra qua nhiềuchu kỳ nhiệt. Thông thường, chỉ có một đoạn DNA được khuếch đại cho mỗi thí nghiệm PCR. Điều này có nghĩa là nếu nhiều đoạn DNA khác nhau được khuếch đại đồng thời (ví dụ như Multiplex PCR), chúng sẽ được tách ra sau đó (ví dụ, điện di gel, theo Pang và cộng sự, 2002). Tuy nhiên, một kỹ thuật khuếch đại DNA mới, được gọi là khuếch đại pha rắn (solid phase amplification-SPA hay SP-PCR), đã được giới thiệu bởi hai nhóm khác nhau: Adessi et al. (2000) và Bing et al. (1996). Bằng cách gắn các đoạn mồi vào bề mặt rắn (attaching the primers to a solid surface), SP-PCR cho phép khuếch đại giới hạn trong một vùng hai chiều được xác định rõ ràng (well-defined two-dimensional area). Vì nó tạo ra một vùng  không gian khuếch đại (spatially located amplification) có thể khuếch đại một số lượng lớn các chuỗi DNA khác nhau trong cùng một phản ứng (nghĩa là trên cùng một bề mặt rắn) mà không cần phối trộn chúng. Đặc tính này có thể rất hữu ích cho việc thiết kế các chip DNA [11].

Công nghệ chip DNA đang trở thành một lĩnh vực quan trọng của nghiên cứu trên quy mô tự động hóa (high-throughput research) trong sinh học cơ bản và bệnh lý (disease pathways). Công nghệ SP-PCR được sử dụng để tạo ra các chip DNA đang phát triển nhanh chóng. Trong lịch sử, phân tích gen được thực hiện bằng cách lai các đầu dò được đánh dấu với các DNA mục tiêu và bị hấp thụ thụ động đến các bề mặt rắn như nitrocellulose, màng nylon hoặc các miếng kính thủy tinh được tráng lysine. Sự liên kết cộng hóa trị của DNA với bề mặt đã trở thành cách tiếp cận lý tưởng vì nó cho phép gắn kết ổn định hơn trong các điều kiện được sử dụng để lai tạo (hybridization).

Nguồn hình: MDPI-Diagnostics (Diagnostics2012, 2(4), 72-82; doi:10.3390/diagnostics2040072)

II. Cơ chế:

SP-PCR khác với PCR truyền thống (solution PCR) trong việc sử dụng bề mặt rắn cố định các đoạn mồi thay vì dạng dung dịch khuyếch tán tự do để khuếch đại DNA. Điều này hạn chế khuếch đại trên bề mặt hai chiều (5’ và 3’) và do đó cho phép dễ dàng song song hóa sự khuếch đại nhiều chuỗi DNA trong một hệ thống. Đối với solution-PCR thường được đặc trưng bằng sự nhân lên các bản saotheo cấp số nhân (ít nhất là trong các chu kỳ đầu) và phân bố đều trong dung dịch với mật độ cao. Tuy nhiên, đặc điểm trên không được biết đến với SP-PCR vì các hiệu ứng không gian (Steric effects) [9] và hình học trong môi trường cố định trên pha rắn.

Có hai kiểu phổ biến của SP-PCR. Trong kiểu thứ nhất, sự khuếch đại DNA được bắt đầu với cả hai primer trong dung dịch để cho phép amplicon [4] được tạo ra với một lượng đủ để kéo dài một primer cố định.Kiểu thứ hai liên quan đến việc tạo ra một amplion cố định bằng cách ghép cả hai primer trên bề mặt.Các primer có thể được cố định trên một đĩacó kích thước lỗ tính bằng micromet (microtiter plate), một mặt phẳng (flat surface), hoặc một microbead [5] được bao phủ trong một micelle [6]. Trong mỗi trường hợp, sự kéo dài của primer bởi enzyme DNA Polymerase tạo ra một amplicon gắn kết (tethered amplicon) có thể dễ dàng phát hiện, định lượng và thao tác cho các ứng dụng tiếp theo bao gồm cloning, high-throughput DNA sequencing [7] và phát hiện SNP [8].

Ý tưởng trung tâm của SP-PCR là gắn đầu 5′-primer vào bề mặtrắn như: silic, polystyrene bead, thủy tinh, polydimethylsiloxane (PDMS), Cyclo-olefin Polymer (COP),Cyclic Olefin Copolymer (COC)và polypropylene (PP) bằng liên kết cộng hóa trịvà đầu 3’ tự do thay vì cho phép các primer tự do khuếch tán trong dung dịch với số lượng lớn(Adessi et. Al., 2000; Bing et al., 1996).

Hình 1[18]: Quá trình liên kết cộng hóa trị gắn các phân tử axit nucleic vào một lớp thủy tinh. Các bề mặt thuỷ tinh chứa nhóm hydroxyl (OH) được silan hóa bằng cách sử dụng amino-silan được minh họa ở đây bằng ATS. Các chất EDC và imidazole tạo ra mối liên kết giữa các bề mặt thủy tinh dẫn xuất amino và các modify oligonucleotide 5′-phosphat trong một phản ứng (a). Đối với hóa học liên kết chéo (b), một liên kết amit được hình thành giữa các nhóm amin của bề mặt và phần tử este succinimidyl của các hợp chất liên kết chéo được minh họa bằng các chất phản ứng s-MBS hoặc s-SIAB. Oligonucleotides, 5′-thiol được cải biến, phản ứng với một trong hai phần maleimid của các hợp chất s-MBS-like hoặc phần iodoacetamide của s-SIAB

Các primer sau đó tạo thành một thảm dày đặc (mật độ là ~ 1011primer  trên mm2-Adessi và cộng sự, 2000-tương ứng với một khoảng cách trung bình từ ~ 5-10 nm giữa các primer, là chiều dài lớn nhất có thể của primer (contour length of a primer). Trong kỹ thuật này, khuếch đại có thể xảy ra thông qua hai quá trình. Đầu tiên, một DNA mục tiêu tự do có thể bị bắt trên bề mặt bởi các primer và sau đó sao chép bằng polymerase (hình 3, a-d), được gọi là interfacial amplification. Lưu ý rằng các bản sao vẫn gắn liền với bề mặt trong khi các phân tử DNA ban đầu quay trở lại dung dịch sau bước gắn primer (annealing step). Sau khi một số bản sao DNA được gắn vào bề mặt thông qua interfacial amplification, một bước khuếch đại thứ hai có thể xảy ra, quá trình ‘surface amplification’. Trong trường hợp này, các bản sao gắn kết bề mặt của các phân tử DNA cũng có thể lai với primer tương ứng và tạo thêm bản sao trong vùng lân cận của các bản sao ban đầu (hình 3, e-l). Điều quan trọng cần lưu ý là quá trình khuếch đại bề mặt này để lại cả hai phân tử gắn liền với bề mặt. Do đó, khuếch đại DNA pha rắn dẫn tới sự phát triển của một nhóm các phân tử gắn liền với bề mặt và nằm trong cùng một vùng. Đặc tính này có thể dễ dàng được khai thác trong việc thiết kế các DNA microarrays [9].

Hình 2 [18]: Khuếch đại DNA bằng PCR pha rắn. Các primer DNA (1 hoặc 2) là 5′-end gắn kết cộng hóa trị với chất rắn. Sự hiện diện của DNA mục tiêu trong dung dịch, nucleotide và enzyme polymerase có khả năng chịu nhiệt dẫn đến sự khuếch đại các phân tử DNA trên bề mặt rắn. Trong chu kỳ ban đầu chỉ có interfacial amplification, vì DNA mục tiêu chỉ có trong dung dịch. Trong các chu kỳ tiếp theo, ngoài interfacial amplification, surface amplificationcũng xảy ra giữa DNA mục tiêu được sao chép (5′-end gắn liền với bề mặt) và các primer trong vùng lân cận.
Hình 3: Mô tả quá trình SP-PCR. Trong chu kỳ đầu tiên (a-b-c-d), DNA được nhân bản bởi sự khuếch đại bề mặt. Kết quả là một ssDNA gắn liền với bề mặt thông qua primer, sau đó được thay thế bằng một DNA mục tiêu mới tự do trong dung dịch. Trong các chu kỳ sau (e-f-g-h và i-j-k-l), chỉ diễn ra quá trình khuếch đại bề mặt. Điều này dẫn đến một dòng DNA mục tiêu tại vị trí của primer đặc hiệu. Lưu ý rằng vì một phân tử luôn sinh ra chuỗi bổ sung của nó trong chu trình nhiệt, hai nhánh bổ sung sẽ có mặt trong một dòng và hai primer(forward và reverse primer) phải được gắn trên bề mặt rắn.

Để có SP-PCR, các primerđước gắn lên bề mặt rắn phải đáp ứng ba yêu cầu chính.

  • Mật độ bề mặt của các primer được gắn lên bề mặt rắnphải đủ cao để phát hiện các sản phẩm khuếch đại DNA cố định bằng phương pháp hybridisation assay sau SP-PCR
  • Liên kết cộng hóa trị giữa primer và bề mặt không nên bị ảnh hưởng bởi chu kỳ nhiệt lặp lại trong quá trình khuếch đại DNA.

Mỗi primer phải được cố định đầu5’lên bề mặt rắn và đảm bảo sự đặc hiệu trong suốt quá trìnhSP-PCR [3].

Một số phương pháp hóa học đã được nghiên cứu để gắn trực tiếp các oligonucleotides 5′-end trên bề mặt rắn như: liên kết cộng hóa trị giữa các oligonucleotide 5′-amino-modified và bề mặt thủy tinh tạo ra epoxy silan, oligonucleotide 5′-succinylated cố định trên bề mặt thủy tinh với dẫn xuất amin,  gắn kết cộng hoá trị với 5′-termini sử dụng các cross-linkers tạo ra các liên kết đồng hóa trị (phenyldiisothiocyanate hoặc anhydrit maleic). Ngoài ra, 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) – carbodiimide hydrochloride (EDC) cũng được sử dụng để gắn các nucleotide vào màng xenlulo thông qua nhóm 5′-phosphate.

III. Quy trình thực hiện SP-PCR trên microbead [3]

Bước 1: Chuẩn bị Fluorescently Encoded Microbeads (silica bead)

Chuẩn bị silica bead có đường kính 6μm [10]
Các microbeads đã được bao phủ (coated)bởi aminopropylsilane, và bề mặt đã được dẫn xuất (derivatized) bằng acid adipic

Bước 2: Chuẩn bị các Oligonucleotides

Các Oligonucleotides không đánh dấu huỳnh quang và đánh dấu huỳnh quang được đặt mua từ các nhà cung cấp như GeneWorks (GeneWorks Pty. Ltd., Adelaide, Australia) và Invitrogen (Invitrogen Corporation, California, USA)

Bước 3: Gắn (Coupling) Oligonucleotides (primer) lên Microbeads

Đầu 5 ‘của forward primer được gắnlên những microbead được bao phủ bởi acidic acid bằng cách sử dụng 1-ethyl 3- (3-dimethylaminopropyl) -carbodiimide (EDC). Các DNA gắn với microbead được thu nhận bằng cách ly tâm ở 10.000rpm trong 30 giây và rửa ba lần với 1 mL 0,1 M 2-morpholinoethane sulfonic acid (đệm MES bổ sung với 0,01% SDS) và được bảo quản ở 4oC

Bước 4: Thực hiện phản ứng SP-PCR

50 pg của single-stranded (ss) DNA template được khuếch đạitrong thể tích phản ứng 30uL

chứa 1.25 U of Taq DNA polymerase (GoTaq Flexi DNApolymerase, Promega Corporation, Wisconsin, USA), 0.2 mM dNTPs, 2.5 mM MgCl2,1X PCR buffer (GoTaq PCR buffer, Promega), 0.1% Tween 20, 0.5µM of A488 reverse primer, khoảng 4×104microbeads đã gắn với đầu 5’forward primer.

Chu kỳ nhiệt PCR (PCR protocol) được thực hiện như sau:

Nhiệt độ Thời gian
Bước 1 94oC 1 phút
Bước 2 94oC 1 phút
Ta (temperature annealing) 2 phút
Lặp lại 30 chu kỳ
Bước 3 72oC 5 phút
Hình 4: SP-PCR. Microbeads có gắn cố định forward primer tại đầu 5’đã nằm trong dung dịch chứa reverse primer và DNA mục tiêu (template). Giai đoạn Anneal (1) DNA bắt vào forward primer cố định trên microbead và cho phép Taq polymerase kéo dài-Extend (2) đầu 3 ‘của primer để tạo ra dsDNA (double strand DNA). dsDNA bị biến tính nhiệt-Denature (3) để cho phép reverse primer gắn vào (anneal) và tổng hợp một sợi amplicon bổ sung. Sự gắn của reverse primer vào dsDNA-Anneal (4)sẽ giúp kéo dài dsDNA-Extend (5) và sự lặp lại chu kỳ denaturation, annealing và kéo dài để tạo ra nhiều amplicon cố định. Mức độ nhân lên của SP-PCR được xác định bằng cách làm biến tính ampliconvà mẫu dògắn trên ssDNA cố định trên bề mặt cùng với một reverse primer có gắn huỳnh quang. Mức huỳnh quang được định lượng bằng cách sử dụng một flow cytometer

Bước 5: DNA Hybridization

Sau SP- PCR, những  amplicon cố định được làm biến tính tại 100°C trong 90 giây bởi 400uL buffer 4X SSC (0.6 M NaCl, 0.06 M sodium citrate) để tạo ra ssDNA cố định. The microbeads đượcthu nhận và bước biến tính được thực hiện lần thứ 2.

50 ng  của reverse primer có đánh dấu huỳnh quang được cho gắn với ssDNA cố định trên microbead  trong 10uL dung dịch miliQ và 4uL hybridization buffer (50mM NaHPO3, 0.5 M NaCl, and 0.5% SDS). Phản ứng này được thực hiện tại nhiệt độ Ta (temperature annealing) của reverse primer trong 60 phút trong thiết bị ủ lắc với tốc độ 1400rpm.

Microbeads sau đó được rửa bằng dung dịch NaOH 0.1N và hòa tan trong 100uL dung dịch SDS 0.1% và chuẩn bị cho bước phân tích bằng flow cytometry.

Bước 6: Phân tích hiệu quả SP-PCR bằng phương pháp Flow Cytometry

Mật độ huỳnh quang trên bề mặt microbeads được đo đạc bằng cách sử dụng DakoCytomation Moflo flow Cytometer. Dữ liệu được thu thập dưới dạng biểu đồ logarit và được phân tích bởi phần mềm Summitv 4.0 để xác định lượng DNA được khuếch đại bởi SP-PC.

Hình 5: Đồ thị biểu diễn sự thay đổi mật độ tín hiệu huỳnh quang theo chu kỳ SP-PCR

IV. Đặc điểm nổi bậtcủa SP-PCR

Cơ chế của SP-PCR định hướng việc thiết kế thí nghiệm để thực hiện phản ứng khuếch đại chỉ diễn ra đối với các DNA đã được gắn lên bề mặt cố định thông qua forward primer.Quá trình SP-PCR được bắt đầu với việc ssDNA template bắt vào các forward cố định trên bề mặt rắn.Sự kéo dài của các primer được tạo ra bởi enzyme DNA polymerase tạo ra các amplicon. Các reverse primer sau đó bắt vào các amplicon cố định và trải qua giai đoạn kéo dài để tạo ra một bản sao của ssDNA template ban đầu. Vì vậy, SP-PCR sẽ chỉ tiếp diễn sau khi các amplicon được tạo ra. Điều này giúp cho SP-PCRlà công cụ giúp khắc phục hiệu quả được 2 nhược điểm chính của multiplex PCR trong dung dịch gồm:

  • Sự hình thành primer-dimer bởi sự tương tác không thể kiểm soát giữa primer-primer và sự khuếch đại ưu thế của một trình tự mục tiêu so với các trình tự khác.
  • Sự xác định chính xác các sản phẩm khuếch đại của multiplex PCR đòi hỏi một phương pháp phân tích thứ 2 sau điện di trên gel, đặc biệt trong trường hợp Multiplex RT-PCR (Reverse transcriptase PCR) như: slab gel electrophoresis, melting curve (Real time PCR), microarray hybridization hoặc điện di mao quản (capillary electrophoresis) để phân tách hoặc xác định kích thước.

Vì vậy, SP-PCR đã và đang được nghiên cứu ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực chẩn đoán nhanh phát hiện bệnh.

V. Những ứng dụng của SP-PCR

Phát hiện nhanh mầm bệnh trong thực phẩm [14]

Hình 6: Nếu các mầm bệnh có mặt trong mẫu thử, thì DNA của chúng sẽ được ghi nhận bằng các đầu dò DNA đặc biệt cố định trên bề mặt bản SAF. Trong quá trình SP-PCR, hàng triệu bản sao của DNA gây bệnh sẽ được tạo ra, và các sản phẩm PCR sẽ được đánh dấu với thuốc nhuộm huỳnh quang (các sao cam) và được phát hiện qua bản SAF

Phát hiện nhanh RNA trong mẫu bệnh cúm gia cầm (AIV) [15]

Bệnh virus cúm gia cầm (AIV) ở Châu Á và dịch bệnh động vật ở một số khu vực ở Châu Âu đã gây ra thiệt hại về kinh tế nghiêm trọng. Multiplex reverse-transcriptase (RT) PCR đã được phát triển để phát hiện và phân typ AIV. Tuy nhiên, số mục tiêu có thể được khuếch đại trong một lần chạy PCR bị hạn chế do nhiễu primer-dimer không kiểm soát được. Trong bài viết này, chúng tôi mô tả một thiết bị lab-on-a-chip để sàng lọc nhanh AIV bằng cách tích hợp DNA microarraydựa trên SP-PCR trên một chip microfluidic. Phương pháp UV cross-linking đơn giản đã được sử dụng để cố định các đầu dò DNA trên bề mặt thủy tinh không có các đệm gắn (unmodified glass surface), điều này làm cho việc tương tác giữa microarray với microfluidic rất thuận tiện. Phương pháp RT-SP-PCR kết hợp khuếch đại RT của RNA tách chiết trong pha lỏng và nested PCR riêng biệt trên pha rắn. Sử dụng phương pháp tiên tiến, virus AIV và các phân typ của chúng đã được xác định rõ ràng bằng các mô hình sản phẩm khuếch đại riêng biệt. Toàn bộ quá trình được giảm xuống dưới 1 giờ và thể tích mẫu được sử dụng trong chip microfluidic ít hơnít nhất 10 lần so với solution PCR. Bằng cách phân chia không gian các primer, sự khuếch đại cao có thể được thực hiện trong SP-PCR. Hơn nữa, multiplex PCR và phát hiện trình tự đã được thực hiện trong một bước, đơn giản hóa việc khảo nghiệm và giảm thời gian xử lý. Hơn nữa, bằng cách kết hợp microarray vào microchamber dựa trên chip PCR, mẫu và mức tiêu hao hóa chất giảm được rất nhiều, và các vấn đề hình thành bọt khí và bốc hơi dung dịch đã được ngăn chặn hiệu quả. Microchip PCR dựa trên microarray này có thể được sử dụng rộng rãi để phát hiện virut và giám sát hiệu quả dịch cúm gia cầm của chim trong môi trường hoang dã và vật nuôi gia cầm.

Hình 7: Mô tả về SP-PCR trên chip để phát hiện nhanh AIV (a) RNA virus và hỗn hợp RT-PCR được bơm lên bề mặt chip. (B) RNA được sao chép ngược để tạo thành cDNA trong chất lỏng. (C) cDNA được khuyếch đại bằng PCR với các primer tự do di chuyển. (D) Các PCR amplicon mới được khuếch đại trong pha lỏng tương tác với các đầu dò lồng nhau cố định trên bề mặt rắn. (E) Các đầu dò phù hợp được mở rộng bởi các enzyme polymerase. (F) Trong chu kỳ tiếp theo, các forward primer trong pha lỏng được gắn vào các đầu dò mở rộng. (G) Các sợi bổ sung được tạo thành và dùng làm mẫu mới cho việc khuếch đại pha rắn. Sau phản ứng, các sản phẩm PCR vẫn gắn với mặt kính thủy tinh thông qua liên kết cộng hóa trị và có thể được quan sát khi các forward primer được gắn đánh dấu huỳnh quang với Cy5.
Hình 8: Tính đặc hiệu của SP-PCR trên chip. (A) Microarray layout. Các máy dò DNA cho gen M và HA đặc hiệu cho H5 và H7 được thể hiện như các vòng tròn màu xám. Mỗi điểm có đường kính 150mm với khoảng cách center-to-centerlà 300 mm. Vòng tròn màu xanh lá cây là những chấm hướng dẫn sử dụng để định hướng. Hình ảnh huỳnh quang sau khi khuếch đại 40 chu kỳ của bốn dòng virut RNA khác nhau: (b) AIV H1N1, (c) AIV H5N1, (d) AIV H7N5 và (e) virus bệnh Newcastle (NDV). Sự phát huỳnh quang mạnh bên ngoài chip là do sự tự phát huỳnh quang của dư lượng PDMS

Phát hiện nhanh chóng sự biến đổi di truyền trong các bệnh ung thư [18]

Lần đầu tiên một kỹ thuật khuếch đại đẳng nhiệt/phát hiện trên bề mặt rắn (ISAD) được nghiên cứu để phát hiện đột biến điểm đơn có thể được thực hiện mà không cần đánh dấu huỳnh quang trong Real time PCR bằng cách sử dụng SPA (solid-phase amplification) trên thiết bị microring silicon (silicon microring-based solid-phase amplification) và enzyme khuếch đại đẳng nhiệt tái tổ hợp (RPA). Kỹ thuật ISAD được thực hiện trên một thiết bị microring silicon với một lỗ nhỏ chứa 10 μL hỗn hợp phản ứng, và đặc trưng để phát hiện sự đột biến điểm đơn gen HRAS (Harvey RAS). VớiSPA, primer của gen đích được gắn trực tiếp vào bề mặt của thiết bị thông qua một phản ứng với nhóm amine. Sự khuếch đại DNA được phát hiệnbằng cách đo sự thay đổi cộng hưởng bước sóng quang học của silic microring trong quá trình phản ứng. Độ nhạy của kỹ thuật ISAD đã được chứng minhcao hơn 100 lần của RPA và phương pháp PCR truyền thống (solution-PCR). Hơn nữa, kỹ thuật này có thể được sử dụng để phân biệt một đột biến điểm đơn của gen HRAS thông qua khuếch đại gen mục tiêu. Kỹ thuật ISAD sẽ hữu ích để phát hiện các trình tự thay đổi như đột biến và SNP được xem như DNA biomarkers trong bệnh của con người.

Hình 9: Sơ đồ đại diện các nguyên tắc của Isothermal SP-PCR / cơ chế phát hiện (A) Ban đầu, một primer được cố định bằng bề mặt của bộ cộng hưởng microring silic và hỗn hợp RPA được đặt trong dung dịch. (B) Các phức hợp enzyme recombinase (vàng) – các phức hợp primer kết hợp để tăng gấp đôi DNA mục tiêu và tạo sự thuận lợi cho việc bắt cặp ở 37 o C. (C) Sau khi dải di chuyển tạo thành một vòng lặp D bằng gp32 (xanh dương), các primer cố định được kéo dài bằng polymerase (màu xanh lá cây) trên bề mặt của bộ cộng hưởng microring silic. (D) sự hình thành của hai duplexes gây ra bởi sự khuếch đại của SP-PCR và solution PCR. (E) Sự khuếch đại DNA ở giai đoạn trên bề mặt rắn đạt được bằng cách lặp lại quá trình này. Trong quá trình phản ứng ISAD, sự khuếch đại và phát hiện mục tiêu đã được giám sát đồng thời bằng cách đo sự thay đổi bước sóng đối với các bộ cộng hưởng microring silic

Ứng dụng trong kỹ thuật giải trình tự NGS [17]

Hình 10: Công nghệ NGS: chuẩn bị mẫu, giải trình tự-ghi nhận dữ liệu và phân tích dữ liệu. Đối với WGS, gDNA được cắt bỏ bằng sonication hoặc nebulisation để tạo thành các đoạn từ 300-500bp. Việc khuếch đại thư viện gen có thể được thực hiện bằng mô hình khuếch đại emPCR hoặc SP-PCR. Trong emPCR (A), một hỗn hợp phản ứng bao gồm một nhũ tương dầu-nước được tạo ra để “đóng gói” các phức hợp DNA-bead vào các giọt dung dịch nhỏ riêng lẽ. Khuếch đại PCR được thực hiện trong các giọt nhỏ này để tạo ra các hạt có chứa vài ngàn bản sao của cùng một trình tự mẫu. Các hạt EmPCR có thể được gắn vào một tấm kính hoặc đưa vào các giếng PicoTiterPlate. SP-PCR (B) bao gồm hai bước cơ bản: khởi đầu và mở rộng mô hình một đơn phân tử, và ssDNA khuôn mẫu không cố định với các primers liền kề để tạo thành các cụm. (C) Giải trình tự và hình ảnh ghi nhận sử dụng một trong những nền tảng được mô tả ở trên. (D) Phân tích dữ liệu sử dụng phần mềm sẵn có hoặc quy trình công việc được tích hợp như GATK.

VI. Tối ưu các thông số cho SP-PCR:

– Rửa microbead với buffer PCR trước khi khuếch đại là điều cần thiết cho sự thành công của SP-PCR.
– Nồng độion Magiê dao động từ 2 đến 3 mM và khuếch đại tối ưu là 2,5 mM.
– Sử dụng 4×104 microbead cho SP-PCR, lượng forward primer thay đổi theo lượng microbead được sử dụng, thông thường khoảng 0.17pmol cho mỗi 4×104 microbead. Một nữa lượng microbead không ảnh hưởng đến sự hình thành các amplicon cố định, trong khi đó lượng bead cao hơn sẽ làm giảm sự hình thành amplicon cố định của SP-PCR
– Thời gian 2 phút là tối ưu cho giai đoạn bắt cặp bổ sung giữa DNA và primer cố định
– Tín hiệu huỳnh quang tăng (lượng amplicon tăng) khi nồng độ DNA template tăng (hình 3). Nhưng khi nồng độ DNA template tăng đến 1ng thì không có sự thay đổi đáng kể lượng amplicon được tạo ra bởi sự bảo hòa trên bề mặt microbead bởi PCR product

Hình 11: Biểu diễn sự thay đổi tín hiệu huỳnh quang tương ứng với nồng độ DNA template

VII. Kết luận:

  • Quy trình khuếch đại DNA theo SP-PCR có thể được tách ra theo ba bước riêng biệt-annealing, extension và denaturation-được lặp đi lặp lại theo một cơ chế chuyên biệt của SP-PCR. Trong chu kỳ đầu tiên, interfacial amplificationlà loại khuyếch đại duy nhất có thể. Kết quả của chu trình đầu tiên là thu được một số lượng nhất định DNA gắn với bề mặt rắn thông qua các forward primer. Trong các chu kỳ tiếp theo, surface amplificationcũng có thể xảy ra vì một số DNA mục tiêuđã được gắn vào bề mặt. Tuy nhiên, khi hai quá trình interfacial amplification và surface amplification cùng tồn tại, sự khuếch đại dạng interfacial amplificationthường chiếm ưu thế hơn (Adessi và cộng sự, 2000). Do đó, để thực hiện quá trình surface amplification, dung dịch ban đầu phải được rửa sạch và thay thế bằng dung dịch không có các DNA mục tiêu. Sau đó, surface amplificationlà khuếch đại duy nhất có thể và chu trình nhiệt độ có thể được bắt đầu trở lại. Kết quả của surface amplificationlà để có được một phân tử ssDNA mới gắn liền với bề mặt ngay sausợi ban đầu (Hình 3, h-i). Lưu ý rằng độ dài của các phân tử được sử dụng trong SPA thường là 400 base (chiều dài đường kính ~ 170 nm). Bán kính của sự chuyển động trong pha hybridization(ssDNA) là khoảng ~ 15-20 nm, lớn hơn khoảng cách trung bình giữa các primer gần nhất (~ 5-10 nm). Ngoài ra, chiều dài DNA điển hình lớn hơn nhiều so với độ dài của ssDNA (~ 10 base hoặc ~ 4 nm) nhưng tương tự như dsDNA (~ 150 basepairs hoặc ~ 51 nm). Do đó, phân tử rất linh hoạt trong pha hybridization, và không có vấn đề cần uốn cong để tìm primers phù hợp. Tuy nhiên, khi kết thúc giai đoạn kéo dài (khi phân tử hoàn toàn là sợi đôi), nó sẽ trở nên cứng và phải chịu áp suất uốn cong đáng kể.
  • Hiệu quả khuếch đạicủa SP-PCRtrong một vùngtrên bề mặt được bao phủ bằng nhiều bản sao của DNA đích và xem như là một DNA colony. Số colony phụ thuộc vào số lượng các DNA mục tiêubắt được (captutred) trên bề mặt rắn bởi forward primer (trong giai đoạn interfacial amplification) trước khi những lượng DNA còn tự do được rửa sạch. Nếu các DNA mục tiêu khác nhau cùng bắt (captured) vào các forward primer cố định khác nhau, sẽ có nhiều loại DNA colony trên bề mặt.
  • Quá trình mô tả trong hình 3 tương ứng với trường hợp lý tưởng, trong đó primer không bị loại bỏ khỏi bề mặt. Trong thực tế, việc nung nóng và làm mát tiếp theo của dung dịch có thể khiến các forward primer tách ra khỏi bề mặt, tùy thuộc vào loại vật liệu được sử dụng làm bề mặt rắn và linker gắn forward primer vào bề mặt rắn. Vì vậy cần nghiên cứu kỹ protocol cho việc cố định các primer khi bắt đầu với SP-PCR[11].
  • Số lượng các phân tử trong một vùng thuộc SPA không tăng theo cấp số nhân (ngoại trừ vài chu kỳ đầu tiên) như trong trường hợp solution- PCR do sự phân bố của phân tử.
  • Đặc điểm trong cơ chế của SP-PCR trong tăng trưởng hình học và phân bố kích thước rõ ràng không bị ảnh hưởng bởi các phân tử xâm nhiễm từ bên ngoài bởi sự bắt cặp đặc hiệu rất cao.
  • AmpaSand bead có thể là một sự lựa chọn đáng xem xét cho SP-PCR [18]

Nguyễn Thanh Phượng

Tài liệu tham khảo

  1. Mercier, Jean-Francois, Gary W. Slater, and Pascal Mayer. “Solid phase DNA amplification: a simple Monte Carlo Lattice model.” Biophysical journal 85.4 (2003): 2075-2086.
  2. Ramkumar Palanisamy., et al., Considerations of Solid-Phase DNA Amplification, Bioconjugate Chem.2010,21,690–695
  3. Celine Adessi., et al., Solid Phase DNA amplification: Characterisation of primer attachment and amplification mechanism, DOI: 10.1093/nar/28.20.e87, Nucleic Acids Research 28(20):E87, 2000
  4. Amplicon. Wikipedia.
  5. Microbead. Wikipedia.
  6. Micelle. Wikipedia.
  7. High-throughput sequencing. Sumanas, Inc.
  8. Kwok, Pui-Yan, and Xiangning Chen. “Detection of single nucleotide polymorphisms.” (2003).
  9. DNA microarray. Wikipedia.
  10. Miller, C. R., Vogel, R., Surawski, P. P., Jack, K. S., Corrie,S. R., and Trau, M. (2005) Functionalized organosilica micro-spheres via a novel emulsion-based route. Langmuir 21, 9733–40.
  11. Jochen Hoffmann,*a Sebastian Hin,a Felix von Stetten,ab Roland Zengerleabc and Günter Rothabc.,Universal protocol for grafting PCR primers onto various lab-on-a-chip substrates for solid-phase PCR.,3885–3889,DOI: 10.1039/c2ra01250b, RSC Advances, 2012, 2.
  12. AmpaSand® Bead technology. Genera Biosystems
  13. Shin, Yong, et al. “Real-time, label-free isothermal solid-phase amplification/detection (ISAD) device for rapid detection of genetic alteration in cancers.” Lab on a Chip 13.11 (2013): 2106-2114.
  14. Fast detection of pathogens in food. DTU Nanotech.
  15. Yi Sun.,et al.,A lab-on-a-chip device for rapid identification of avian influenza viral RNA by solid-phase PCR, DOI: 10.1039/c0lc00528b, Lab on a chip journal, 8, 2011
  16. El Mustapha Bahassi, Peter J Stambrook.,Next-generation sequencing technologies: Breaking the sound barrier of human genetics, DOI: 10.1093/mutage/geu031, 2014
  17. Yong Shin., et al.,Real-time, label-free isothermal solid-phase amplification/detection (ISAD) device for rapid detection of genetic alteration in cancers, DOI: 10.1039/C3LC50129A, Lab on a chip journal, 11, 2013
  18. AmpaSand® Bead technology. Genera Biosystems
Ý Kiến Độc Giả:

Nhóm nghiên cứu: