Giới thiệu phản ứng chuỗi polymerase pha rắn SP-PCR

I. Giới thiệu:

Từ khi được phát minh vào năm 1983, phản ứng chuỗi polymerase (PCR) đã tạo ra một bước đột phá lớn cho ngành sinh học phân tử bằng cách cho phép các nhà nghiên cứu tạo ra số lượng bản sao không giới hạn của một đoạn DNA chỉ trong vài giờ. PCR thường được thực hiện bằng cách phối trộn các thành phần cần thiết vào tube. Sự khuếch đại sau đó diễn ra qua nhiềuchu kỳ nhiệt. Thông thường, chỉ có một đoạn DNA được khuếch đại cho mỗi thí nghiệm PCR. Điều này có nghĩa là nếu nhiều đoạn DNA khác nhau được khuếch đại đồng thời (ví dụ như Multiplex PCR), chúng sẽ được tách ra sau đó (ví dụ, điện di gel, theo Pang và cộng sự, 2002). Tuy nhiên, một kỹ thuật khuếch đại DNA mới, được gọi là khuếch đại pha rắn (solid phase amplification-SPA hay SP-PCR), đã được giới thiệu bởi hai nhóm khác nhau: Adessi et al. (2000) và Bing et al. (1996). Bằng cách gắn các đoạn mồi vào bề mặt rắn (attaching the primers to a solid surface), SP-PCR cho phép khuếch đại giới hạn trong một vùng hai chiều được xác định rõ ràng (well-defined two-dimensional area). Vì nó tạo ra một vùng  không gian khuếch đại (spatially located amplification) có thể khuếch đại một số lượng lớn các chuỗi DNA khác nhau trong cùng một phản ứng (nghĩa là trên cùng một bề mặt rắn) mà không cần phối trộn chúng. Đặc tính này có thể rất hữu ích cho việc thiết kế các chip DNA [11].

Công nghệ chip DNA đang trở thành một lĩnh vực quan trọng của nghiên cứu trên quy mô tự động hóa (high-throughput research) trong sinh học cơ bản và bệnh lý (disease pathways). Công nghệ SP-PCR được sử dụng để tạo ra các chip DNA đang phát triển nhanh chóng. Trong lịch sử, phân tích gen được thực hiện bằng cách lai các đầu dò được đánh dấu với các DNA mục tiêu và bị hấp thụ thụ động đến các bề mặt rắn như nitrocellulose, màng nylon hoặc các miếng kính thủy tinh được tráng lysine. Sự liên kết cộng hóa trị của DNA với bề mặt đã trở thành cách tiếp cận lý tưởng vì nó cho phép gắn kết ổn định hơn trong các điều kiện được sử dụng để lai tạo (hybridization).

II. Cơ chế:

SP-PCR khác với PCR truyền thống (solution PCR) trong việc sử dụng bề mặt rắn cố định các đoạn mồi thay vì dạng dung dịch khuyếch tán tự do để khuếch đại DNA. Điều này hạn chế khuếch đại trên bề mặt hai chiều (5’ và 3’) và do đó cho phép dễ dàng song song hóa sự khuếch đại nhiều chuỗi DNA trong một hệ thống. Đối với solution-PCR thường được đặc trưng bằng sự nhân lên các bản saotheo cấp số nhân (ít nhất là trong các chu kỳ đầu) và phân bố đều trong dung dịch với mật độ cao. Tuy nhiên, đặc điểm trên không được biết đến với SP-PCR vì các hiệu ứng không gian (Steric effects) [9] và hình học trong môi trường cố định trên pha rắn.

Có hai kiểu phổ biến của SP-PCR. Trong kiểu thứ nhất, sự khuếch đại DNA được bắt đầu với cả hai primer trong dung dịch để cho phép amplicon [4] được tạo ra với một lượng đủ để kéo dài một primer cố định.Kiểu thứ hai liên quan đến việc tạo ra một amplion cố định bằng cách ghép cả hai primer trên bề mặt.Các primer có thể được cố định trên một đĩacó kích thước lỗ tính bằng micromet (microtiter plate), một mặt phẳng (flat surface), hoặc một microbead [5] được bao phủ trong một micelle [6]. Trong mỗi trường hợp, sự kéo dài của primer bởi enzyme DNA Polymerase tạo ra một amplicon gắn kết (tethered amplicon) có thể dễ dàng phát hiện, định lượng và thao tác cho các ứng dụng tiếp theo bao gồm cloning, high-throughput DNA sequencing [7] và phát hiện SNP [8].

Ý tưởng trung tâm của SP-PCR là gắn đầu 5′-primer vào bề mặtrắn như: silic, polystyrene bead, thủy tinh, polydimethylsiloxane (PDMS), Cyclo-olefin Polymer (COP),Cyclic Olefin Copolymer (COC)và polypropylene (PP) bằng liên kết cộng hóa trịvà đầu 3’ tự do thay vì cho phép các primer tự do khuếch tán trong dung dịch với số lượng lớn(Adessi et. Al., 2000; Bing et al., 1996).

Các primer sau đó tạo thành một thảm dày đặc (mật độ là ~ 10¹¹primer  trên mm²-Adessi và cộng sự, 2000-tương ứng với một khoảng cách trung bình từ ~ 5-10 nm giữa các primer, là chiều dài lớn nhất có thể của primer (contour length of a primer). Trong kỹ thuật này, khuếch đại có thể xảy ra thông qua hai quá trình. Đầu tiên, một DNA mục tiêu tự do có thể bị bắt trên bề mặt bởi các primer và sau đó sao chép bằng polymerase (hình 3, a-d), được gọi là interfacial amplification. Lưu ý rằng các bản sao vẫn gắn liền với bề mặt trong khi các phân tử DNA ban đầu quay trở lại dung dịch sau bước gắn primer (annealing step). Sau khi một số bản sao DNA được gắn vào bề mặt thông qua interfacial amplification, một bước khuếch đại thứ hai có thể xảy ra, quá trình ‘surface amplification’. Trong trường hợp này, các bản sao gắn kết bề mặt của các phân tử DNA cũng có thể lai với primer tương ứng và tạo thêm bản sao trong vùng lân cận của các bản sao ban đầu (hình 3, e-l). Điều quan trọng cần lưu ý là quá trình khuếch đại bề mặt này để lại cả hai phân tử gắn liền với bề mặt. Do đó, khuếch đại DNA pha rắn dẫn tới sự phát triển của một nhóm các phân tử gắn liền với bề mặt và nằm trong cùng một vùng. Đặc tính này có thể dễ dàng được khai thác trong việc thiết kế các DNA microarrays [9].

Để có SP-PCR, các primerđước gắn lên bề mặt rắn phải đáp ứng ba yêu cầu chính.

• Mật độ bề mặt của các primer được gắn lên bề mặt rắnphải đủ cao để phát hiện các sản phẩm khuếch đại DNA cố định bằng phương pháp hybridisation assay sau SP-PCR
• Liên kết cộng hóa trị giữa primer và bề mặt không nên bị ảnh hưởng bởi chu kỳ nhiệt lặp lại trong quá trình khuếch đại DNA.

Mỗi primer phải được cố định đầu5’lên bề mặt rắn và đảm bảo sự đặc hiệu trong suốt quá trìnhSP-PCR [3].

Một số phương pháp hóa học đã được nghiên cứu để gắn trực tiếp các oligonucleotides 5′-end trên bề mặt rắn như: liên kết cộng hóa trị giữa các oligonucleotide 5′-amino-modified và bề mặt thủy tinh tạo ra epoxy silan, oligonucleotide 5′-succinylated cố định trên bề mặt thủy tinh với dẫn xuất amin,  gắn kết cộng hoá trị với 5′-termini sử dụng các cross-linkers tạo ra các liên kết đồng hóa trị (phenyldiisothiocyanate hoặc anhydrit maleic). Ngoài ra, 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) – carbodiimide hydrochloride (EDC) cũng được sử dụng để gắn các nucleotide vào màng xenlulo thông qua nhóm 5′-phosphate.

III. Quy trình thực hiện SP-PCR trên microbead [3]

Bước 1: Chuẩn bị Fluorescently Encoded Microbeads (silica bead)

Chuẩn bị silica bead có đường kính 6μm [10]
Các microbeads đã được bao phủ (coated)bởi aminopropylsilane, và bề mặt đã được dẫn xuất (derivatized) bằng acid adipic

Bước 2: Chuẩn bị các Oligonucleotides

Các Oligonucleotides không đánh dấu huỳnh quang và đánh dấu huỳnh quang được đặt mua từ các nhà cung cấp như GeneWorks (GeneWorks Pty. Ltd., Adelaide, Australia) và Invitrogen (Invitrogen Corporation, California, USA)

Bước 3: Gắn (Coupling) Oligonucleotides (primer) lên Microbeads

Đầu 5 ‘của forward primer được gắnlên những microbead được bao phủ bởi acidic acid bằng cách sử dụng 1-ethyl 3- (3-dimethylaminopropyl) -carbodiimide (EDC). Các DNA gắn với microbead được thu nhận bằng cách ly tâm ở 10.000rpm trong 30 giây và rửa ba lần với 1 mL 0,1 M 2-morpholinoethane sulfonic acid (đệm MES bổ sung với 0,01% SDS) và được bảo quản ở 4^oC

Bước 4: Thực hiện phản ứng SP-PCR

50 pg của single-stranded (ss) DNA template được khuếch đạitrong thể tích phản ứng 30uL

chứa 1.25 U of Taq DNA polymerase (GoTaq Flexi DNApolymerase, Promega Corporation, Wisconsin, USA), 0.2 mM dNTPs, 2.5 mM MgCl2,1X PCR buffer (GoTaq PCR buffer, Promega), 0.1% Tween 20, 0.5µM of A488 reverse primer, khoảng 4×10⁴microbeads đã gắn với đầu 5’forward primer.

Chu kỳ nhiệt PCR (PCR protocol) được thực hiện như sau:

Bước 5: DNA Hybridization

Sau SP- PCR, những  amplicon cố định được làm biến tính tại 100°C trong 90 giây bởi 400uL buffer 4X SSC (0.6 M NaCl, 0.06 M sodium citrate) để tạo ra ssDNA cố định. The microbeads đượcthu nhận và bước biến tính được thực hiện lần thứ 2.

50 ng  của reverse primer có đánh dấu huỳnh quang được cho gắn với ssDNA cố định trên microbead  trong 10uL dung dịch miliQ và 4uL hybridization buffer (50mM NaHPO3, 0.5 M NaCl, and 0.5% SDS). Phản ứng này được thực hiện tại nhiệt độ Ta (temperature annealing) của reverse primer trong 60 phút trong thiết bị ủ lắc với tốc độ 1400rpm.

Microbeads sau đó được rửa bằng dung dịch NaOH 0.1N và hòa tan trong 100uL dung dịch SDS 0.1% và chuẩn bị cho bước phân tích bằng flow cytometry.

Bước 6: Phân tích hiệu quả SP-PCR bằng phương pháp Flow Cytometry

Mật độ huỳnh quang trên bề mặt microbeads được đo đạc bằng cách sử dụng DakoCytomation Moflo flow Cytometer. Dữ liệu được thu thập dưới dạng biểu đồ logarit và được phân tích bởi phần mềm Summitv 4.0 để xác định lượng DNA được khuếch đại bởi SP-PC.

IV. Đặc điểm nổi bậtcủa SP-PCR

Cơ chế của SP-PCR định hướng việc thiết kế thí nghiệm để thực hiện phản ứng khuếch đại chỉ diễn ra đối với các DNA đã được gắn lên bề mặt cố định thông qua forward primer.Quá trình SP-PCR được bắt đầu với việc ssDNA template bắt vào các forward cố định trên bề mặt rắn.Sự kéo dài của các primer được tạo ra bởi enzyme DNA polymerase tạo ra các amplicon. Các reverse primer sau đó bắt vào các amplicon cố định và trải qua giai đoạn kéo dài để tạo ra một bản sao của ssDNA template ban đầu. Vì vậy, SP-PCR sẽ chỉ tiếp diễn sau khi các amplicon được tạo ra. Điều này giúp cho SP-PCRlà công cụ giúp khắc phục hiệu quả được 2 nhược điểm chính của multiplex PCR trong dung dịch gồm:

• Sự hình thành primer-dimer bởi sự tương tác không thể kiểm soát giữa primer-primer và sự khuếch đại ưu thế của một trình tự mục tiêu so với các trình tự khác.
• Sự xác định chính xác các sản phẩm khuếch đại của multiplex PCR đòi hỏi một phương pháp phân tích thứ 2 sau điện di trên gel, đặc biệt trong trường hợp Multiplex RT-PCR (Reverse transcriptase PCR) như: slab gel electrophoresis, melting curve (Real time PCR), microarray hybridization hoặc điện di mao quản (capillary electrophoresis) để phân tách hoặc xác định kích thước.

Vì vậy, SP-PCR đã và đang được nghiên cứu ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực chẩn đoán nhanh phát hiện bệnh.

V. Những ứng dụng của SP-PCR

Phát hiện nhanh mầm bệnh trong thực phẩm [14]

Phát hiện nhanh RNA trong mẫu bệnh cúm gia cầm (AIV) [15]

Bệnh virus cúm gia cầm (AIV) ở Châu Á và dịch bệnh động vật ở một số khu vực ở Châu Âu đã gây ra thiệt hại về kinh tế nghiêm trọng. Multiplex reverse-transcriptase (RT) PCR đã được phát triển để phát hiện và phân typ AIV. Tuy nhiên, số mục tiêu có thể được khuếch đại trong một lần chạy PCR bị hạn chế do nhiễu primer-dimer không kiểm soát được. Trong bài viết này, chúng tôi mô tả một thiết bị lab-on-a-chip để sàng lọc nhanh AIV bằng cách tích hợp DNA microarraydựa trên SP-PCR trên một chip microfluidic. Phương pháp UV cross-linking đơn giản đã được sử dụng để cố định các đầu dò DNA trên bề mặt thủy tinh không có các đệm gắn (unmodified glass surface), điều này làm cho việc tương tác giữa microarray với microfluidic rất thuận tiện. Phương pháp RT-SP-PCR kết hợp khuếch đại RT của RNA tách chiết trong pha lỏng và nested PCR riêng biệt trên pha rắn. Sử dụng phương pháp tiên tiến, virus AIV và các phân typ của chúng đã được xác định rõ ràng bằng các mô hình sản phẩm khuếch đại riêng biệt. Toàn bộ quá trình được giảm xuống dưới 1 giờ và thể tích mẫu được sử dụng trong chip microfluidic ít hơnít nhất 10 lần so với solution PCR. Bằng cách phân chia không gian các primer, sự khuếch đại cao có thể được thực hiện trong SP-PCR. Hơn nữa, multiplex PCR và phát hiện trình tự đã được thực hiện trong một bước, đơn giản hóa việc khảo nghiệm và giảm thời gian xử lý. Hơn nữa, bằng cách kết hợp microarray vào microchamber dựa trên chip PCR, mẫu và mức tiêu hao hóa chất giảm được rất nhiều, và các vấn đề hình thành bọt khí và bốc hơi dung dịch đã được ngăn chặn hiệu quả. Microchip PCR dựa trên microarray này có thể được sử dụng rộng rãi để phát hiện virut và giám sát hiệu quả dịch cúm gia cầm của chim trong môi trường hoang dã và vật nuôi gia cầm.

Phát hiện nhanh chóng sự biến đổi di truyền trong các bệnh ung thư [18]

Lần đầu tiên một kỹ thuật khuếch đại đẳng nhiệt/phát hiện trên bề mặt rắn (ISAD) được nghiên cứu để phát hiện đột biến điểm đơn có thể được thực hiện mà không cần đánh dấu huỳnh quang trong Real time PCR bằng cách sử dụng SPA (solid-phase amplification) trên thiết bị microring silicon (silicon microring-based solid-phase amplification) và enzyme khuếch đại đẳng nhiệt tái tổ hợp (RPA). Kỹ thuật ISAD được thực hiện trên một thiết bị microring silicon với một lỗ nhỏ chứa 10 μL hỗn hợp phản ứng, và đặc trưng để phát hiện sự đột biến điểm đơn gen HRAS (Harvey RAS). VớiSPA, primer của gen đích được gắn trực tiếp vào bề mặt của thiết bị thông qua một phản ứng với nhóm amine. Sự khuếch đại DNA được phát hiệnbằng cách đo sự thay đổi cộng hưởng bước sóng quang học của silic microring trong quá trình phản ứng. Độ nhạy của kỹ thuật ISAD đã được chứng minhcao hơn 100 lần của RPA và phương pháp PCR truyền thống (solution-PCR). Hơn nữa, kỹ thuật này có thể được sử dụng để phân biệt một đột biến điểm đơn của gen HRAS thông qua khuếch đại gen mục tiêu. Kỹ thuật ISAD sẽ hữu ích để phát hiện các trình tự thay đổi như đột biến và SNP được xem như DNA biomarkers trong bệnh của con người.

Ứng dụng trong kỹ thuật giải trình tự NGS [17]

VI. Tối ưu các thông số cho SP-PCR:

– Rửa microbead với buffer PCR trước khi khuếch đại là điều cần thiết cho sự thành công của SP-PCR.
– Nồng độion Magiê dao động từ 2 đến 3 mM và khuếch đại tối ưu là 2,5 mM.
– Sử dụng 4×104 microbead cho SP-PCR, lượng forward primer thay đổi theo lượng microbead được sử dụng, thông thường khoảng 0.17pmol cho mỗi 4×104 microbead. Một nữa lượng microbead không ảnh hưởng đến sự hình thành các amplicon cố định, trong khi đó lượng bead cao hơn sẽ làm giảm sự hình thành amplicon cố định của SP-PCR
– Thời gian 2 phút là tối ưu cho giai đoạn bắt cặp bổ sung giữa DNA và primer cố định
– Tín hiệu huỳnh quang tăng (lượng amplicon tăng) khi nồng độ DNA template tăng (hình 3). Nhưng khi nồng độ DNA template tăng đến 1ng thì không có sự thay đổi đáng kể lượng amplicon được tạo ra bởi sự bảo hòa trên bề mặt microbead bởi PCR product

VII. Kết luận:

• Quy trình khuếch đại DNA theo SP-PCR có thể được tách ra theo ba bước riêng biệt-annealing, extension và denaturation-được lặp đi lặp lại theo một cơ chế chuyên biệt của SP-PCR. Trong chu kỳ đầu tiên, interfacial amplificationlà loại khuyếch đại duy nhất có thể. Kết quả của chu trình đầu tiên là thu được một số lượng nhất định DNA gắn với bề mặt rắn thông qua các forward primer. Trong các chu kỳ tiếp theo, surface amplificationcũng có thể xảy ra vì một số DNA mục tiêuđã được gắn vào bề mặt. Tuy nhiên, khi hai quá trình interfacial amplification và surface amplification cùng tồn tại, sự khuếch đại dạng interfacial amplificationthường chiếm ưu thế hơn (Adessi và cộng sự, 2000). Do đó, để thực hiện quá trình surface amplification, dung dịch ban đầu phải được rửa sạch và thay thế bằng dung dịch không có các DNA mục tiêu. Sau đó, surface amplificationlà khuếch đại duy nhất có thể và chu trình nhiệt độ có thể được bắt đầu trở lại. Kết quả của surface amplificationlà để có được một phân tử ssDNA mới gắn liền với bề mặt ngay sausợi ban đầu (Hình 3, h-i). Lưu ý rằng độ dài của các phân tử được sử dụng trong SPA thường là 400 base (chiều dài đường kính ~ 170 nm). Bán kính của sự chuyển động trong pha hybridization(ssDNA) là khoảng ~ 15-20 nm, lớn hơn khoảng cách trung bình giữa các primer gần nhất (~ 5-10 nm). Ngoài ra, chiều dài DNA điển hình lớn hơn nhiều so với độ dài của ssDNA (~ 10 base hoặc ~ 4 nm) nhưng tương tự như dsDNA (~ 150 basepairs hoặc ~ 51 nm). Do đó, phân tử rất linh hoạt trong pha hybridization, và không có vấn đề cần uốn cong để tìm primers phù hợp. Tuy nhiên, khi kết thúc giai đoạn kéo dài (khi phân tử hoàn toàn là sợi đôi), nó sẽ trở nên cứng và phải chịu áp suất uốn cong đáng kể.
• Hiệu quả khuếch đạicủa SP-PCRtrong một vùngtrên bề mặt được bao phủ bằng nhiều bản sao của DNA đích và xem như là một DNA colony. Số colony phụ thuộc vào số lượng các DNA mục tiêubắt được (captutred) trên bề mặt rắn bởi forward primer (trong giai đoạn interfacial amplification) trước khi những lượng DNA còn tự do được rửa sạch. Nếu các DNA mục tiêu khác nhau cùng bắt (captured) vào các forward primer cố định khác nhau, sẽ có nhiều loại DNA colony trên bề mặt.
• Quá trình mô tả trong hình 3 tương ứng với trường hợp lý tưởng, trong đó primer không bị loại bỏ khỏi bề mặt. Trong thực tế, việc nung nóng và làm mát tiếp theo của dung dịch có thể khiến các forward primer tách ra khỏi bề mặt, tùy thuộc vào loại vật liệu được sử dụng làm bề mặt rắn và linker gắn forward primer vào bề mặt rắn. Vì vậy cần nghiên cứu kỹ protocol cho việc cố định các primer khi bắt đầu với SP-PCR[11].
• Số lượng các phân tử trong một vùng thuộc SPA không tăng theo cấp số nhân (ngoại trừ vài chu kỳ đầu tiên) như trong trường hợp solution- PCR do sự phân bố của phân tử.
• Đặc điểm trong cơ chế của SP-PCR trong tăng trưởng hình học và phân bố kích thước rõ ràng không bị ảnh hưởng bởi các phân tử xâm nhiễm từ bên ngoài bởi sự bắt cặp đặc hiệu rất cao.
• AmpaSand bead có thể là một sự lựa chọn đáng xem xét cho SP-PCR [18]

Nguyễn Thanh Phượng

Tài liệu tham khảo

1. Mercier, Jean-Francois, Gary W. Slater, and Pascal Mayer. “Solid phase DNA amplification: a simple Monte Carlo Lattice model.” Biophysical journal 85.4 (2003): 2075-2086.
2. Ramkumar Palanisamy., et al., Considerations of Solid-Phase DNA Amplification, Bioconjugate Chem.2010,21,690–695
3. Celine Adessi., et al., Solid Phase DNA amplification: Characterisation of primer attachment and amplification mechanism, DOI: 10.1093/nar/28.20.e87, Nucleic Acids Research 28(20):E87, 2000
4. Amplicon. Wikipedia.
5. Microbead. Wikipedia.
6. Micelle. Wikipedia.
7. High-throughput sequencing. Sumanas, Inc.
8. Kwok, Pui-Yan, and Xiangning Chen. “Detection of single nucleotide polymorphisms.” (2003).
9. DNA microarray. Wikipedia.
10. Miller, C. R., Vogel, R., Surawski, P. P., Jack, K. S., Corrie,S. R., and Trau, M. (2005) Functionalized organosilica micro-spheres via a novel emulsion-based route. Langmuir 21, 9733–40.
11. Jochen Hoffmann,*a Sebastian Hin,a Felix von Stetten,ab Roland Zengerleabc and Günter Rothabc.,Universal protocol for grafting PCR primers onto various lab-on-a-chip substrates for solid-phase PCR.,3885–3889,DOI: 10.1039/c2ra01250b, RSC Advances, 2012, 2.
12. AmpaSand^® Bead technology. Genera Biosystems
13. Shin, Yong, et al. “Real-time, label-free isothermal solid-phase amplification/detection (ISAD) device for rapid detection of genetic alteration in cancers.” Lab on a Chip 13.11 (2013): 2106-2114.
14. Fast detection of pathogens in food. DTU Nanotech.
15. Yi Sun.,et al.,A lab-on-a-chip device for rapid identification of avian influenza viral RNA by solid-phase PCR, DOI: 10.1039/c0lc00528b, Lab on a chip journal, 8, 2011
16. El Mustapha Bahassi, Peter J Stambrook.,Next-generation sequencing technologies: Breaking the sound barrier of human genetics, DOI: 10.1093/mutage/geu031, 2014
17. Yong Shin., et al.,Real-time, label-free isothermal solid-phase amplification/detection (ISAD) device for rapid detection of genetic alteration in cancers, DOI: 10.1039/C3LC50129A, Lab on a chip journal, 11, 2013
18. AmpaSand^® Bead technology. Genera Biosystems