CRISPR/Cas9: Kỹ thuật tiên tiến trong sinh học phân tử – Những lý thuyết tiếp cận chuyên sâu (P2)

  • Chi tiết bài viết
  • Bài viết liên quan
Rate this post

CRISPR/Cas9 đang thu hút sự quan tâm của hầu hết các nhà khoa học trên toàn thế giới trong lĩnh vực chỉnh sửa bộ gen và các lĩnh vực sinh học khác cũng được hưởng lợi từ kỹ thuật này. Được khám phá từ một cơ chế tự vệ trong vi khuẩn, hệ thống này có thể dễ dàng lập trình để cắt và chỉnh sửa bất kỳ trình tự DNA nào ở các loài khác nhau. Vậy, cơ chế của nó như thế nào? Ứng dụng vào những gì? Quy trình thực hiện ra sao? Liệu ngoài những ưu điểm, CRISPR/Cas9 có nhược điểm nào không?

Bài 1: Cơ chế hoạt động của hệ thống CRISPR/Cas9

Bài 2: Ứng dụng linh hoạt CRIPSR/Cas9 trong chỉnh sửa bộ gen

1. Gen silencing/knockout

Cas9 endonuclease đã trở thành một công cụ phổ biến để chỉnh sửa gen trực tiếp trong hệ thống tế bào nhân thật (eukaruotic system). Với việc sử dụng một mục tiêu cụ thể CRISPR RNA (crRNA) và trans-kích hoạt crRNA (tracrRNA), hoặc một dạng hợp nhất gọi là RNA dẫn đường (gRNA). Sự phá vỡ bởi Cas9 tại những vị trí nhất định trong bộ gen phức tạp ở động vật có vú có thể được sửa chữa bởi các cơ chế sửa chữa DNA nội sinh thông qua một quá trình được gọi chung là sự bổ sung của những đoạn không tương đồng (NHEJ- non-homologous end-joining). Bởi vì NHEJ tạo ra những vị trí lỗi, xóa gen hoặc chèn (insertion/deletion-indels) có thể dẫn đến sự thay đổi khung cấu trúc gen và cảm ứng cơ chế kết thúc sớm để làm gen mục tiêu im lặng (gene silencing), tức không thể biểu hiện. Điều quan trọng cần lưu ý là sự chèn hoặc bị loại bỏ có kết quả từ NHEJ là ngẫu nhiên và khác nhau ở những tế bào khác nhau. Những thay đổi về gen một cách chính xác có thể được xác định bằng thực nghiệm bổ sung vào dòng tế bào vô tính. Các crRNA, tracrRNA, và gRNAs có thể được sao chép trong tế bào, trong ống nghiệm hoặc tổng hợp và biểu hiện thông qua sự biến nạp vào tế bào. Sự biểu hiện trong tế bào của Cas9 endonuclease có thể được thực hiện bằng plasmid hoặc vectơ biểu hiện lentivirus tích hợp điều khiển bởi các promoter hoặc cảm ứng.

2. DNA-free CRISPR-Cas9 gene editing

Hệ thống chỉnh sửa gen CRISPR/Cas9 với DNA-free có nghĩa là gì? Nó có nghĩa là hệ thống này không sử dụng các thành phần CRISPR-Cas9 dưới dạng vector DNA; mỗi thành phần là RNA hoặc protein. Bắt đầu với Cas9 mRNA hoặc protein Cas9 tinh khiết là nguồn cho Cas9 biểu hiện hoạt tính nuclease trong các thí nghiệm kỹ thuật gen có lợi thế cho một số ứng dụng. Tại sao? Việc sử dụng các Cas9 dựa trên DNA hoặc gRNA mang theo nó những khả năng biến đổi gen không mong muốn do plasmid DNA tích hợp vào các vùng cắt hoặc tích hợp vector lentivirus ngẫu nhiên. Vì lý do này, một hệ thống chỉnh sửa gen DNA-free có thể là một lựa chọn tốt cho việc tạo ra các dòng tế bào mong muốn. Nếu thử nghiệm liên quan đến việc quan sát của một kiểu hình trong quần thể mà không phải tế bào vô tính, các nhà nghiên cứu có thể không cần phải lựa chọn DNA-free. Tuy nhiên, nếu mục tiêu cuối cùng của thử nghiệm không yêu cầu làm giàu các tế bào Cas9 và tránh các sự tương tác có thể xem xét sử dụng Cas9 mRNA hoặc protein Cas9 tinh khiết.

3. Homology-directed repair (HDR)

Hệ thống CRISPR-Cas9 cắt DNA sợi đôi mục tiêu cũng có thể được sử dụng để tạo ra một gen knockin [4], chứ không phải là mục tiêu gen knockout. Sự chèn chính xác của một trình tự lạ có thể làm thay đổi vùng mã hóa của một gen để “sửa chữa” một đột biến, một loại protein, hoặc tạo ra một vùng giới hạn mới. Một vài nghiên cứu đã chứng minh rằng DNA sợi đơn có thể được sử dụng để tạo ra sự chèn chính xác bằng cách sử dụng crRNA và tracrRNA tổng hợp kết hợp với Cas9 nuclease. Ngoài ra, các hoạt động của Cas9 có thể được thay đổi để cắt chỉ một sợi thay vì sợi đôi. Các Cas9 nickase có thể được sử dụng với một cặp phức hợp crRNA: tracrRNA hoặc sgRNAs hướng mục tiêu đến hai vùng gần nhau trên 2 sợi đối diện, và khi được sử dụng với DNA sợi đôi ngắn, HDR có thể thực hiện.

4. Transient gene silencing or transcriptional repression (CRISPRi)

Với ứng dụng này, Cas9 được cải biến để nó không thể cắt DNA, và khi kết hợp với một gRNA nhằm vào vùng promoter mục tiêu, phức hợp này có thể làm giảm hoạt động phiên mã và biểu hiện gen đồng thời.

5. Transient activation of endogenous genes (CRISPRa or CRISPRon)

Bằng cách sử dụng một đột biến Cas9 mà nó không thể cắt DNA và một vùng kích hoạt phiên mã đã được hợp nhất, sự biểu hiện của gen nội sinh có thể tăng lên bởi protein dung hợp Cas9 hướng tới vùng promoter của gen đích nội sinh, hoặc nhiều gen đồng thời.

6. Embryonic stem cell and transgenic animals

Hệ thống CRISPR-Cas có thể được sử dụng như một kỹ thuật nhanh chóng và hiệu quả cho một hoặc nhiều thay đổi di truyền trên các tế bào gốc phôi của chuột nhằm tạo ra các thế hệ của những chuột con biến đổi gen. Một cách tiếp cận tương tự đã được sử dụng để biến đổi di truyền tế bào phôi đơn lẻ ở động vật linh trưởng.

7. Pooled genome-scale knockout screening

Các thư viện lentivirus đã được sử dụng MOI thấp để thực hiện sàng lọc hệ gen với khả năng tồn tại tế bào ung thư, pluripotency, và kháng thuốc. Với việc tích hợp số lượng bản sao duy nhất, bi-allelic gene silencing có thể được thực hiện với tần số cao. Đại diện tương đối của các gen tham gia vào tạo ra các kiểu hình quan trọng của quá trình sàng lọc (ví dụ tế bào chết, tăng sinh, kháng thuốc, vv) có thể được xác định bởi trình tự của các thế hệ tiếp theo

Tham khảo:

[3] http://dharmacon.gelifesciences.com/applications/gene-editing/
[4] https://en.wikipedia.org/wiki/Gene_knockin

Nguồn hình minh họa: http://www.nature.com/nrc/journal/v15/n7/full/nrc3950.html

Đón đọc các phần tới:

Bài 3: Phương thức sử dụng CRISPR/Cas9 tạo đột biến indel knockout gen mục tiêu

Bài 4: Ưu điểm của hệ thống CRISPR/Cas9 so với các kỹ thuật sửa đổi gen khác 

Tác giả: IBSG Molecular Cell Biology

Cố vấn và biên tập: Tiến sĩ Nguyễn Ngọc Phương Thảo 

Ý Kiến Độc Giả:

Nhóm nghiên cứu: